中国新型冠状病毒核酸检测现状 假阴性依然存在


发布时间:2020-04-13 09:24 浏览量 95 views
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    新型冠状病毒肺炎(COVID-19:Corona Virus Disease 2019 )对人类健康安全造成巨大威胁。截至北京时间4月13日6时30分,全球共计报告超184万例确诊病例。

    在抗击新型冠状病毒肺炎的战斗中,无论在国内还是国外,新型冠状病毒核酸检测成为大家十分关注的焦点。

    在国家卫生健康委办公厅印发的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》(试行第七版)和《新型冠状病毒肺炎防控方案》(第六版)中显示,采用实时荧光定量RT-PCR检测新型冠状病毒核酸结果不仅是诊断新型冠状病毒肺炎无症状感染者和确诊病例的必须证据之一,而且也是疑似病例排除诊断、确诊住院病例出院以及无症状患者集中隔离后解除隔离的重要依据之一。

    为了让大家更加清晰地了解新型冠状病毒核酸检测的意义,对国内外实施的诊疗方案和防控方案的进一步理解,以及配合当地政府做好个人以及企事业单位复工复产、境外人员管理以及人员流动等方面的防控,本文将详细介绍国内外新型冠状病毒核酸检测的相关进展。

    一、病毒感染常用实验室检查方法

    病毒是可以导致人体致病的常见病原体之一。医学上,检查人体是否被病毒感染的常见实验室方法包括:

    1.1 光学显微镜下观察病毒的形态:适合于观察大型病毒,如痘病病毒和病毒感染后人体细胞胞质或胞核内出现有特点的包涵体,如巨细胞病毒感染后上皮细胞的核内出现的“猫头鹰眼”样的嗜酸性包涵体等。

    1.2电子显微镜下观察病毒的形态:直接观察到临床标本或培养物中有特征性的病毒颗粒,如轮状病毒、疱疹病毒、冠状病毒等,技术复杂,报告时间长,主要用于病毒的科学研究。

    1.3 病毒培养:病毒是专性细胞寄生,需要在活细胞或动物体内才能分离培养。根据培养过程或动物接种后的变化特征、流行病学资料和标本来源可进行初步鉴定,有助于确定病毒的种类。由于病毒的分离培养与鉴定需要特殊实验室环境、技术复杂、且周期长,多用于病毒相关的科学研究,很少用于临床诊断。

    1.4 病毒抗原的检测:用独特的医学免疫学检测技术检测标本中的特异性病毒抗原,如目前检测乙型肝炎病毒感染时所用的乙型肝炎表面抗原检测等。

    1.5 病毒相关的血清学抗体检测:采用独特的医学免疫学检测技术检测被感染者血清中所产生的病毒相关的特异性抗体,如目前检测甲型肝炎病毒感染所用的甲型肝炎抗体检测、艾滋病病毒感染所用的艾滋病病毒抗体检测等;

    1.6 病毒核酸序列检测:是病毒感染诊断的“金标准”方法。通过直接测定被感染者提供的样本中病毒的核酸序列来确诊。近年来依托于基因测序技术的发展,病毒基因测序速度有了很大提高,同时病毒基因测序成本有大幅降低,因此,目前广泛应用于DNA病毒、RNA病毒以及不同种属病毒混合感染时的临床样本检测以及科学研究。由于病毒基因测序需要特殊的设备、特殊的实验室环境、人员的特殊培训、检测成本要高以及检测报告时间长等,比较适合于特殊情况下对患者样本的确认检测,或者疑难病原体的检测,一般不适合用于大批量样本的筛查。

    1.7 病毒核酸片段的扩增检测:当病毒的核酸序列已知的前提下,可以应用聚合酶链式反应(PCR)和(或)分子杂交技术直接扩增DNA病毒核酸片段、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR扩增和分析RNA病毒核酸的特异性片段,实现对病毒感染的诊断和治疗观察的目的。例如,用PCR技术检测乙型肝炎病毒肝炎患者血液中乙型肝炎病毒核酸等。

    二、新型冠状病毒的实验室检查方法

    新型冠状病毒肺炎(COVID-19)病毒是已知可感染人类的第7种冠状病毒,属于冠状病毒β属,有包膜,颗粒呈圆形或者椭圆形,直径60-140nm,基因组为线性的单股正链RNA。人群普遍易感,潜伏期1-14天,呼吸道飞沫和密切接触传播是主要的传播途径,在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下存在气溶胶传播的风险。

    综上所述,适合于新型冠状病毒检测的实验室方法包括:

    (1)病毒的特异性抗原检测

    (2)病毒相关的特异性血清学抗体检测

    (3)病毒基因测序

    (4)RT-PCR方法对病毒核酸片段的扩增

    三、医疗机构开展新型冠状病毒核酸检测条件

    由于新型冠状病毒的生物学特点、流行病学特征以及致病性和临床表现不同于一般传染病,因此国家卫生健康委办公厅于2020年1月23日专门印发了《新型冠状病毒实验室生物安全指南》,明确规定:

    (1)新型冠状病毒按照病原微生物危害程度分类中第二类病原微生物进行管理;

    (2)新型冠状病毒培养和动物感染实验必须在生物安全三级实验室内进行;

    (3)未经培养的感染性材料的操作,其中包括用于病毒抗原检测、血清学检测、核酸检测、生化分析等未经灭活的临床标本,需要在生物安全二级实验室进行,而实验室技术人员的防护采用生物安全三级实验室的标准;

    (4)即使采用可靠方法灭活后的临床样本的检测,也必须在生物安全二级实验室进行。

    目前,我国医疗机构实验室建设和实验室技术人员的防护虽然要求参照国家生物安全二级实验室的标准执行,但是由于所有实验室的生物安全并没有强制要求必须通过权威机构的认证和审核,因此虽然部分二级医院、大多数的三级医院按照卫健委颁布的《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》建立了符合病毒核酸检测的实验室,比如乙型肝炎病毒,巨细胞病毒等,面对此次传播力极强的新型冠状病毒以及国家卫健委发布的《新型冠状病毒实验室生物安全指南》,很多实验室生物安全实际达不到指南要求,通过上级主管部门的审核,成为新型冠状病毒核酸检测筛查和确认实验室。

    这样一来,即使全国很多医院成为了接受新型冠状病毒肺炎疑似病例的定点单位,可以接受新型冠状病毒肺炎可疑病人的就诊,但并不能开展新型冠状病毒核酸检测,因此,部分新型冠状病毒肺炎的定点医院需要将可疑患者的样本转送到生物安全合格、被当地卫健委确认通过的实验室进行检测。

    四、国内新型冠状病毒核酸检测能力

    4.1 新型冠状病毒核酸检测试剂现状

    (1)核酸检测试剂研究基础

    经过多年的发展,目前国内病毒核酸检测试剂研发和生产能力已经达到国际同类水平,国内可以生产病毒核酸检测试剂的厂家至少有几百上千家。国内常见病毒核酸检测试剂,如乙型肝炎病毒核酸检测、丙型肝炎病毒核酸检测、EB病毒核酸检测等,基本都实现了国产代替进口,国产试剂有很高的性价比,在医疗机构临床实验室得到广泛普及应用。

    新型冠状病毒是一种单股正链RNA病毒。目前检测RNA病毒核酸的方法有多种,常用的技术为逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),该技术是通过提取临床样本中病毒的RNA,然后通过逆转录成为互补DNA(cDNA)再行PCR扩增后检测。

    建立RT-PCR技术检测新型冠状病毒核酸的检测方法首先需要获得新型冠状病毒的基因组序列。回顾此次武汉爆发的新型冠状病毒肺炎时间轴,从2019年12月8日武汉市卫生健康委员会报首例新型冠状病毒肺炎确诊病例开始,到2020年1月2日,中科院武汉病毒所获得新型冠状病毒全基因组序列止,大概花了26天时间。而2天后,也就是2020年1月4日,国家疾病控制中心就研制出高特异性的核酸检测(荧光PCR法)试剂,并于1月11日开始向武汉提供核酸检测(荧光PCR法)试剂。在一个多月时间里,完成一种全新病毒的全基因测序到核酸试剂开发、应用全过程,这在以前是不敢想象的。在此次全国、特别是武汉抗击新型冠状病毒阻击战斗中,能够在短时间内实验对疑似病例进行全面的核酸检测,应该说完全得益于国家近几年对基因检测技术的重视和科研投入。

    (2)药监局注册通过的核酸检测试剂种类

    根据我国医疗器械的管理规定,原则上,用于临床疾病诊治的检测试剂必须取得国家药品监督管理局的注册证。而正常情况下,试剂注册前,必须对试剂的性能,包括精密度、准确度、分析特异性以及稳定性等进行系统确认。由于新型冠状病毒肺炎在武汉的爆发性流行,截至目前,国家药监局已经应急批准23个新型冠状病毒检测产品,其中新冠病毒核酸检测试剂15个,抗体检测试剂8个。

表1 23个已批准新型冠状病毒检测试剂未命名_副本.jpg


    由于所有试剂研发时间比较短,一些常规注册流程下试剂注册需要提交的数据和资料有难度,因此,在每一个批准的核酸检测试剂备注栏中,国家药监局都注明被批准的试剂用于新型冠状病毒感染的肺炎的辅助诊断和应急储备,注册证有效期为半年或一年(正常流程注册试剂有效期为五年),延续注册时必须按照国家药监局《体外诊断试剂注册管理办法》的要求完善所有注册申报资料才行。

    4.2 新型冠状病毒核酸检测实验室数量

    新型冠状病毒核酸检测方法主要采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),属于临床分子细胞遗传学领域。为了规范我国分子细胞遗传实验室的管理,国家卫健委2002年发布了《临床基因扩增实验室暂行办法》<卫医发(2002)10号>,2010年发布了《医疗机构基因扩增实验室管理办法》<卫办医政发(2010)194号>。上述办法中详细规定了基因扩增实验室的建设标准、技术人员以及质量管理要求。在《临床基因扩增实验室暂行办法》的指导下,我国近20年来,部分二级医疗机构、几乎所有的三级医疗机构都建立了标准的基因扩增检测实验室,并通过属地化上级单位审核。

    同时,近年来,国家医疗改革的大好形势下,鼓励民营资本进医疗,出现了大批独立于医院的第三方独立医学实验室,其中还出现了几家在全国拥有十多家、几十家连锁独立医学实验室的龙头企业,其中包括广州金域医学、华大基因、杭州千麦等第三方独立医学实验室集团,这些独立医学实验室因为平时业务的需求,也基本都建立了标准的基因扩增实验室。

    目前,国内可以申请承担新型冠状病毒核酸检测的实验室包括:

    (1)全国各级疾控中心的核酸检测实验室;

    (2)各级新型冠状病毒定点医疗机构的基因扩增检测实验室;

    (3)第三方独立医学实验室的分子生物学实验室;

    由于新型冠状病毒不同于一般的病毒,人群普遍易感,呼吸道飞沫和密切接触传播是主要的传播途径,在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下存在气溶胶传播的风险。因此,国家卫生健康委办公厅印发的《新型冠状病毒肺炎防控方案》(第六版)中明确规定,核酸检测需要在生物安全二级实验室进行,而实验室技术人员的防护采用生物安全三级实验室的标准;为了保证整个检测过程的生物安全,上述实验室中如果希望开展新型冠状病毒核酸检测,需要首先向上级主管部门提出申请,通过主管部门专家现场质量和生物安全审核后,即可以获得授权对外开展新型冠状病毒核酸检测。而暂时条件不成熟、审核未通过的各级新型冠状病毒定点医疗机构,可以将样本转送至属地化的CDC或者与有授权的第三方实验室进行检测。

    4.3 目前我国新型冠状病毒核酸检测质量状况

    由于核酸检测是新型冠状病毒肺炎确诊、筛查、解除隔离以及患者出院的重要依据,不管试剂研发时间的长短,注册时需要提交的材料还有哪些需要完善,检测患者样本时的质量都必须符合行业内、患者疾病诊治的要求。

    为了解我国新型冠状病毒核酸检测的开展现状以及质量状况,国家卫生健康委临床检验中心于2020年3月16日-24日在全国31个省份(含自治区、直辖市)开展新型冠状病毒核酸检测室间质量评价。此次评价活动采用国家卫生健康委临检中心自制的、以基因工程方法制备的噬菌体病毒颗粒、无生物传染危害、其浓度采用数字PCR定量而来的模拟样本12份,发放到有能力开展新型冠状病毒核酸检测的疾病预防控制中心、二级或三级公立医疗机构(含综合医院、专科医院以及妇幼保健机构)、独立医学实验室、海关所属国际旅行卫生保健中心、试剂研发厂家、科研院所等,最后共收到844家实验室的有效结果。按照12份模拟样本检测结果完全正确判断为质量合格,否则不合格的标准,844家实验室中,有701家实验室检测结果完全符合,质量合格,合格率为83.1%;143家实验室检测结果不完全正确,为质量不合格,不合率为16.9%

    五、新型冠状病毒核酸检测结果影响因素

    根据国家卫生健康委办公厅印发的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》(试行第七版),核酸检测是新型冠状病毒肺炎确诊的重要实验室依据之一。而来自武汉一线临床的数据显示,新型冠状病毒核酸检测的阳性率仅为30%-50%,而核酸检测结果阴性的患者中,有相当数量患者最后证实为新型冠状病毒感染者。因此,了解影响新型冠状病毒核酸检测准确性的因素具有十分重要的指导意义。

    5.1 造成新型冠状病毒核酸检测结果假阴性的因素

    假阴性:指患者临床诊断为新型冠状病毒感染,但核酸检测结果为阴性。

    (1)样本来源

    根据国家卫生健康委办公厅印发的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》(试行第七版),推荐核酸检查样本可以采集鼻咽拭子、痰和气道抽取物等下呼吸道标本、血液、粪便等,但强调检测痰和气道抽取物更加准确,因此,被检测者不同的样本来源检测结果会有差异。

    (2)样本采集的有效性

    虽然国家卫健委诊疗方案推荐的新型冠状病毒核酸检测样本类型有多种,但作为呼吸道传播的疾病,最直接的样本来源自然还是采集鼻咽拭子、痰和气道抽取物等呼吸道标本。由于新型冠状病毒肺炎患者咳嗽为干咳,因此即使是确诊的患者,也不是所有患者都可以采集到合适的痰标本;另外,采集痰标本需要患者咳出,而新型冠状病毒本身就是通过呼吸道传播,因此,被采样者咳痰的过程也会是一个病毒高度传播的过程,除非在特殊的环境里进行样本采集。而气道抽取物难度更大,只能适合于住院治疗中的患者。因此,对于大规模的筛查检测,采集鼻咽拭子作为新型冠状病毒核酸检测样本,不失为一种最佳选择。

    鼻咽拭子标本采集(图1)不同于一般标本采集,采集人员需要一定的专业技术培训,才可以真正按照采集规范采集到新型冠状病毒感染的细胞。

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 图1 鼻咽拭子采集


    (3)样本采集的时期

    感染早期,有可能样本中病毒数量比较少,检测结果为阴性。

    (4)样本采集后的保存和运输

    新型冠状病毒是RNA病毒,RNA不同于DNA,很容易降解。如果样本采集后较长时间在室温保存(4小时以上),病毒中的RNA就会降解,而导致核酸检测结果为阴性。

    (5)选择的试剂盒的质量

    如前4.3所述,不同厂家生产的试剂质量有一定的差别。特别是因疫情防控所需,短时间内研发注册的试剂,很多需要进行确认的试剂性能未完成。如果使用前,没有经过严格的质量确认,所选择的试剂质量、稳定性等有可能对检测结果有一定的影响。导致本该阳性的结果检测为阴性。

    (6)实验室检测能力

    核酸检测不同于常规标本的检测,对技术人员的业务水平、实验室环境以及管理要求较高,每一个环节的任何不规范,都会对检测结果产生影响。

    5.2 造成新型冠状病毒核酸检测结果假阳性的因素

    假阳性:患者没有被新型冠状病毒感染,但核酸检测结果为阳性。

    (1)技术人员实验过程中,操作失误,导致样本互相交叉污染;

    (2)检测结果判读不合理,阈值取舍不合适,将本该结果为阴性的样本错误判定为阳性;

    (3)所用试剂特异性不高,出现假阳性结果;

    六、国外新型冠状病毒核酸检测试剂情况

    虽然在此次抗击新型冠状病毒阻击战斗中,我们完全依托国内企业自主研发和生产的新型冠状病毒核酸检测试剂,首战告捷,但国外新型冠状病毒肺炎感染形势却越来越不容乐观。很多国家在这突如其来的疫情面前,新型冠状病毒感染实验室检测试剂出现较大缺口。为应对抗击疫情的紧急需求,国外大型试剂诊断公司,比如德国罗氏诊断产品有限公司、美国雅培诊断公司等同样也发力加紧新型冠状病毒检测试剂的研发和生产,并陆续推出自己的新型冠状病毒核酸检测产品。目前德国罗氏的新型冠状病毒核酸检测试剂和设备获得了美国FDA紧急使用授权,并在美国新型冠状病毒感染筛查和患者诊断中得到广泛应用。同时,美国雅培公司于近期也推出了自己的核酸检测试剂和设备。

    为了协助国外新型冠状病毒肺炎爆发国家共同抗疫,我国也有多家新型冠状病毒核酸检测试剂通过CE认证、美国FDA紧急使用授权等。为了保证出口国外试剂的质量安全,规范病毒检测试剂盒市场秩序,对医疗防疫物资商业采购提供指引,帮助国内外供需双方进行有效对接,国家药品监督管理局于2020年3月30日发布了《中国对新型冠状病毒检测试剂和防护用品的监管要求及标准》(中、英文),同时商务部、海关总署和国家药品监督管理局三部门共同发文,要求自2020年4月1日起,出口新型冠状病毒检测试剂的企业向海关报关时,须提供书面或电子声明,承诺出口产品已取得我国医疗器械产品注册证书,符合进口国(地区)的质量标准要求。

    七、新型冠状病毒核酸检测的应用和注意事项

    7.1 新型冠状病毒核酸检测的应用

    新为了正确使用新型冠状病毒核酸检测这一实验室指标,指导我国新型冠状病毒肺炎的诊治和防控,国家卫生健康委办公厅印发的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》(试行第七版)和《新型冠状病毒肺炎防控方案》(第六版)中明确规定:

    1、实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性是新型冠状病毒肺炎确诊证据之一。

    2、连续两次痰、鼻咽拭子等呼吸道标本核酸检测结果阴性(采集时间间隔24小时)是新型冠状病毒患者治愈出院的必须标准。

    3、疑似病例单人单间隔离治疗后,连续两次痰、鼻咽拭子等呼吸道标本核酸检测结果阴性(采集时间间隔24小时)是解除隔离的重要依据之一。

    4、通过新型冠状病毒肺炎患者密切接触者筛查、聚集性疫情调查以及传染源追踪调查等途径发现呼吸道标本中新型冠状病毒核酸检测阳性的无症状感染者时,需要集中隔离14天,连续两次痰、鼻咽拭子等呼吸道标本核酸检测结果阴性(采集时间间隔24小时)后,才可以解除隔离。

    7.2 新型冠状病毒核酸检测应用注意事项

    1、如前所述,新型冠状病毒核酸检测结果受多种因素影响,检测结果阴性时并不能完全排除新型冠状病毒感染,因此,如果属于新型冠状病毒感染高风险人群,最好的办法就是进行新型冠状病毒核酸检测的同时,进行14天的隔离。

    2、由于新型冠状病毒核酸检测阴性并不能完全排除新型冠状病毒的感染,因此,对于政府防控措施中规定需要进行隔离的人群,可以选择同时进行核酸检测筛查,尽早发现被感染者,但不建议用核酸检测取代隔离和其它防控措施。


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        文章来源: 国家卫健委、国家药监局、国家临床检验中心官网、人民网,于 2020-04-13 09:24,由 找我测 编辑发表 。

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